Hello！小伙伴們大家好，你是否在日常工作中遇到一些化合物難以用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段分析的情況，這時(shí)候我們應(yīng)該怎么辦呢？衍生是一種不錯(cuò)的選擇方式，今天就跟小編一起來(lái)了解下衍生技術(shù)在液相色譜中的應(yīng)用，看看她是如何幫我們克服難題的吧。

化學(xué)衍生法是指借助化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)組分接上某種特定基團(tuán)，從而改善其檢測(cè)靈敏度和分離效果的方法利用化學(xué)衍生反應(yīng)達(dá)到改變化臺(tái)物特性的目的，使其更適用于特定分析的過(guò)程，在儀器分析中被廣泛應(yīng)用，如色譜（包括氣相 、液相 、超臨界、薄層 、電泳和一些聯(lián)用技術(shù)等）、質(zhì)譜 、核磁 、紫外一可見 、熒光和電化學(xué)分析等。

氣相色譜中應(yīng)用化學(xué)衍生反應(yīng)是為了增加樣品的揮發(fā)度或提高檢測(cè)靈敏度，而高效液相色譜和毛細(xì)管電泳的化學(xué)衍生法是指在一定條件下利用某種試劑（通稱化學(xué)衍生試劑或標(biāo)記試劑）與樣品組份進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物有助于色譜檢測(cè)或分離。

液相色譜衍生化技術(shù)是色譜分析中常用的輔助手段。衍生技術(shù)可以解決目標(biāo)物保留性差、不穩(wěn)定、常規(guī)檢測(cè)方法不能直接檢測(cè)或檢測(cè)靈敏度比較低等問(wèn)題。液相色譜儀的衍生技術(shù)是指將待測(cè)物與某種試劑即我們通常稱的衍生試劑反應(yīng)，使之生成易于檢測(cè)的化合物的過(guò)程。衍生化反應(yīng)從是否形成共價(jià)鍵來(lái)說(shuō)，可分為兩種：標(biāo)記和非標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記反應(yīng)是在反應(yīng)過(guò)程中，被分析物與標(biāo)記試劑之間生成共價(jià)鍵。所有其它類型的反應(yīng)，如形成離子對(duì)、光解、氧化還原、電化學(xué)反應(yīng)等都是非標(biāo)記反應(yīng)。

另一種區(qū)分衍生化反應(yīng)是從衍生反應(yīng)的場(chǎng)所來(lái)分，有柱前衍生化 (pre-column derivatization)，柱上衍生化 (on-column derivatization)和柱后衍生化 (post-column derivatization)三種。

從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來(lái)分有：在線 (on-line)、離線(of-line)和旁線 (at—line)(自動(dòng)化)三種。

使用意大利HT4000A自動(dòng)樣品處理工作站，可完成復(fù)雜的多重自動(dòng)化衍生操作，如下圖所示，不同品牌液相搭配HT4000A自動(dòng)樣品處理工作站均可實(shí)現(xiàn)離線、在線或旁線衍生。

目前在 HPLC中以離線的柱前衍生法（簡(jiǎn)稱柱前衍生法）與在線的柱后衍生法（簡(jiǎn)稱柱后衍生法）使用居多。旁線衍生法常用的反應(yīng)有酯化、?；?、烷基化、硅烷化、硼wan化、環(huán)化和離子化和光化學(xué)反應(yīng)等。

HT4000A衍生——渦旋混合

接下來(lái)我們一起來(lái)看看衍生的不同方式

第一種方式將被測(cè)物轉(zhuǎn)變成可檢測(cè)的衍生物后，再通過(guò)色譜柱分離。即將被測(cè)物和衍生試劑分別通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)輸液泵送到反應(yīng)器里混合，并使之立即反應(yīng)完成，隨之進(jìn)入色譜柱，這就是在線柱前衍生了；

也可以先將被測(cè)物和衍生試劑反應(yīng)，再將衍生物作為樣品進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，此時(shí)該方法為離線柱前衍生；有的文獻(xiàn)中提到也可以在流動(dòng)相中加入衍生試劑，進(jìn)樣后，讓被測(cè)物與流動(dòng)相直接發(fā)生衍生反應(yīng)這樣就是在線衍生。

柱后衍生是指先將被測(cè)物分離，再將從色譜柱流出的溶液與衍生試劑在線混合，生成可檢測(cè)的衍生物，然后導(dǎo)入檢測(cè)器。按生成衍生物的類型可分為紫外可見光衍生、熒光衍生、拉曼衍生和電化學(xué)衍生和光化學(xué)衍生等。

氨基酸柱后/柱前衍生示意圖

1、紫外可見光衍生：

1）紫外衍生是指將紫外吸收弱或無(wú)紫外吸收的有機(jī)化合物與帶有紫外吸收基團(tuán)的衍生試劑反應(yīng)，使之生成可以用紫外檢測(cè)的化合物。如胺類化合物容易與鹵代烴、羰基、?；愌苌噭┓磻?yīng)。

2）可見光衍生有兩個(gè)主要的應(yīng)用：一是用于過(guò)渡金屬離子的檢測(cè)，將過(guò)渡金屬離子與顯色劑反應(yīng)，生成有色的配合物、螯合物或離子締合物后用可見光檢測(cè)；二是用于有機(jī)離子的檢測(cè)，在流動(dòng)相中加入被測(cè)離子的反離子，使之形成有色的離子對(duì)化合物后，分離檢測(cè)。

2、熒光衍生：

熒光衍生是指將被測(cè)物與熒光衍生試劑反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。有的熒光衍生試劑本身沒(méi)有熒光，而其衍生物卻有很強(qiáng)的熒光。衍生技術(shù)不僅使液相色譜儀分析體系復(fù)雜化，而且需要消耗時(shí)間，增加分析成本，有的衍生反應(yīng)還需要控制嚴(yán)格的反應(yīng)條件。因此，只有在找不到方便而靈敏的檢測(cè)方法或?yàn)榱颂岣叻蛛x檢測(cè)的選擇性時(shí)，才考慮用衍生技術(shù)。

3、光化學(xué)衍生：

光化學(xué)衍生（PhotoChemical Derivatization, PCD）分析法是基于光化學(xué)反應(yīng)而建立的一類分析方法，它以其du特的衍生方式與傳統(tǒng)的熒光，化學(xué)發(fā)光，紫外-可見，電化學(xué)等檢測(cè)方法相結(jié)合，提高了原有方法的靈敏度與選擇性，極大地拓展了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍，在藥物、復(fù)雜生物樣品，環(huán)境樣品分析測(cè)定等方面得到廣泛應(yīng)用。

柱后化學(xué)衍生反應(yīng)主要以熒光分析為主，也有以電化學(xué)檢測(cè)的分析方法。光化學(xué)反應(yīng)的主要類別如下：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移、碰撞能量轉(zhuǎn)移、淬滅、光致離子化、異構(gòu)化、直接反應(yīng)、分子間分解。

WelView光化學(xué)衍生器

AFT經(jīng)柱后光化學(xué)衍生后，能發(fā)射特征性熒光，被熒光檢測(cè)器捕獲后而得到檢測(cè)，最后經(jīng)色譜工作站處理數(shù)據(jù)。 光化學(xué)衍生搭配FLD檢測(cè)器可以有效的檢測(cè)低濃度的黃曲霉毒素，方法靈敏度遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)方法。

光化學(xué)衍生器與HPLC聯(lián)用示意圖

色譜柱：月旭氨基酸分析柱 Amino Acid，5μm，4.6×250mm。