對(duì)于老生常談的分析方法驗(yàn)證（analyticalmethod validation），小編以為，是通過(guò)過(guò)程用數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明分析方法的可行性，以證明所用的分析方法適用于相應(yīng)的檢測(cè)要求。

一、哪些項(xiàng)目需要進(jìn)行方法驗(yàn)證呢？

1、鑒別實(shí)驗(yàn)；

2、原料（指API）或制劑中有效成分含量的測(cè)定；

3、制劑中其他成分，如抗氧劑、抑菌劑及其他認(rèn)為需要進(jìn)行監(jiān)控的成分含量的測(cè)定；

4、原料或制劑中雜質(zhì)（包括工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)）的定量或*；

5、溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測(cè)試方法。

二、分析方法驗(yàn)證所包含的內(nèi)容：

1、專屬性Specificity；

2、準(zhǔn)確度Accuracy ，也被稱為回收率Recovery；

3、精密度Precision（包括重復(fù)性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現(xiàn)性Reproducibility）；

4、檢測(cè)限（Detection Limit，LOD）；

5、定量限（Quantitation Limit，LOQ）；

6、線性（Linearity）；

7、范圍（Range）；

8、耐用性（Robustness）。

三、各項(xiàng)內(nèi)容的具體解析

1、專屬性Specificity：

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的能力。能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力，是指該方法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)是否受到相互干擾程度的度量。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢査和含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。

A. 鑒別反應(yīng)

應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。不含被測(cè)成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。

B.含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

采用的色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。

?在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分離。

?在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進(jìn)行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行峰純度檢查。

綜上，專屬性包括兩方面：

一是對(duì)各組分進(jìn)行定位，以稀釋劑和空白輔料不干擾檢測(cè)評(píng)價(jià)專屬性是否良好；

二是經(jīng)強(qiáng)制降解后的樣品主峰與相鄰雜質(zhì)峰間分離度符合要求（≥1.5）。

2、準(zhǔn)確度Accuracy：

準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，用回收率%表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)試驗(yàn)，準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、線性和專屬性推算出來(lái)。如上圖所示，左邊為準(zhǔn)確度高的結(jié)果，右側(cè)為準(zhǔn)確度低的結(jié)果。測(cè)定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。

準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)要求：規(guī)定的范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少 6 份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)高中低3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。對(duì)于有關(guān)物質(zhì)檢查的準(zhǔn)確度，還需對(duì)定量限水平的準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

A. 化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度
原料藥可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定，或用所測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

B. 化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度
可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到雜質(zhì)對(duì)照品，可用所建立的方法與另一成熟方法（如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法）的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

C. 中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度
可用已知純度的對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

3、精密度Precision（包括重復(fù)性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現(xiàn)性Reproducibility）

（如上圖所示，左邊的圖精密度良好，但是準(zhǔn)確度不符合要求；右邊的圖平均值的準(zhǔn)確度符合要求，但是精密度較差）。

精密度系指在規(guī)定的測(cè)定條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；

重復(fù)性數(shù)據(jù)要求：在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少測(cè)定6份的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用至少9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)， 濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。

在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度，中間精密度是考察隨機(jī)變動(dòng)因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，一個(gè)完善的分析方法驗(yàn)證應(yīng)進(jìn)行中間精密度的測(cè)試。

在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。在常規(guī)的分析方法驗(yàn)證中，未必都會(huì)進(jìn)行重現(xiàn)性的考察。但是在分析方法從研發(fā)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)到QC實(shí)驗(yàn)室的過(guò)程中，通常會(huì)進(jìn)行重現(xiàn)性的考察。

含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度。

精密度數(shù)據(jù)要求：應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考ChP2015版中9101中可接受范圍表。

偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式如下所示：

4、檢測(cè)限（DetectionLimit，LOD）

檢測(cè)限是指試樣在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物能被檢測(cè)出的低濃度或含量。它是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。檢測(cè)限的測(cè)定包括以下幾種方法：

A.直觀法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的低濃度或量。

B.信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。

C.標(biāo)準(zhǔn)差法：

①測(cè)定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σb；

②將σb乘以三倍；

③在工作曲線上求出3σb相對(duì)應(yīng)的濃度Xb；即為檢出限；

④將求得的對(duì)應(yīng)濃度值加上空白值（空白值為0則不加）即得檢出限。

5、定量限（QuantitationLimit，LOQ）

定量限是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。定量限試驗(yàn)方法包括：

A.非儀器分析目視法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的符合準(zhǔn)確度和精密度要求的低濃度或量。

B.信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的低濃度或量。一般以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。

C.基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法：按照 LOQ = 10δ/S 公式計(jì)算。

式中 LOQ：定量限；

δ：響應(yīng)值的偏差；

S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
δ 可以通過(guò)下列方法測(cè)得：

①測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。

定量限數(shù)據(jù)要求：定量限需同時(shí)滿足精密度要求和準(zhǔn)確度要求。

6、線性（Linearity）

線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值或其經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化的形式與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的程度。

應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎猛粚?duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5種不同濃度的供試樣品。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。或者可采用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。

線性數(shù)據(jù)要求：至少需要五個(gè)濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、 y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖。

7、范圍（Range）

范圍系指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。

?原料藥和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的80%～120%；

?制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測(cè)定濃度的 70%～130%, 特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；

?溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的－20%至上限的＋20%；

?雜質(zhì)測(cè)定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為雜質(zhì)報(bào)告水平至規(guī)定限度的 120%計(jì)算，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的－20%至含量限度（或上限）的＋20%。

在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。

范圍是綜合了線性、精密度，準(zhǔn)確度后的結(jié)果，不一定與線性范圍一致。

8、耐用性（Robustness）

耐用性又稱粗放度，系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫(xiě)明，并注明可以接受變動(dòng)的范圍，可以先采用均勻設(shè)計(jì)確定主要影響因素，再通過(guò)單因素分析等確定變動(dòng)范圍。

典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等。

液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有：流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。

氣相色譜法變動(dòng)因素有：不同品牌或批號(hào)的色譜柱、不同類型的擔(dān)體、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。

經(jīng)試驗(yàn)， 測(cè)定條件小的變動(dòng)應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求， 以確保方法的可靠性。

液相色譜的典型變動(dòng)：

• 流動(dòng)相PH（±0.5)；
• 流動(dòng)相組成(有機(jī)相±5%）；
• 色譜柱（同一廠家的三個(gè)批號(hào)，或兩個(gè)不同廠家（固定相和填充物相同，尺寸）
• 溫度（20-25℃)和流速(±10%）
• 檢測(cè)波長(zhǎng)(±5nm)

氣相色譜的典型變動(dòng)：
• 色譜柱（同一廠家的三個(gè)批號(hào)，或兩個(gè)不同廠家（同固定相和填充物，尺寸）
• 溫度
• 流速

分析方法的驗(yàn)證比較簡(jiǎn)單，只要按照指導(dǎo)原則對(duì)每一個(gè)驗(yàn)證模塊去仔細(xì)地完成，肯定不會(huì)出錯(cuò)。哪怕不是很了解驗(yàn)證的目的，在大框架上也不會(huì)出錯(cuò)。當(dāng)然，對(duì)于方法驗(yàn)證中每個(gè)模塊的深入了解，能幫助我們?cè)谌粘９ぷ髦懈玫卦O(shè)計(jì)方法學(xué)的驗(yàn)證，能讓方法學(xué)驗(yàn)證更加科學(xué)，合理，并且能更加地完成。